Тимофей вместе с Павлом отправились в путешествие через Македонию в Верию (Деян 17:14), где задержался, и затем пришел к Павлу в Афины (ст. 15). Оттуда Павел послал его в Фессалонику (Фес. 3:1 и дал.), после чего Тимофей пришел к апостолу в Коринф с радостными вестями (1Фес 3:6), и оставался там, в то время, когда Павел писал свои два послания к Фессалоникийцам (Деян 18:5, 1Фес 1:1, 2Фес 1:1). Затем он сопровождал Павла в Ефес (Деян 18:18 и дал.), откуда был им послан в Македонию и Коринф (1Кор 4:17, 1Кор 16:10). После этого он снова прибыл к Павлу в Македонию, когда тот писал второе послание к Коринфянам 2Кор 1:1, и последовал за ним в Коринф, откуда Павел писал свое послание к Римлянам (Рим 16:21). Тимофей, отделившись от Павла на обратном пути последнего в Иерусалим, ожидал его в Троаде (Деян 20:3 и дал.). Впоследствии он разделял его заключение в Кесарии и Риме (Кол 1:1, Флм 1:1, Флп 1:1). Павел надеялся послать его из Рима в Филиппы (Флп 2:19).
Затем, согласно 1Тим 1:3, в одно из путешествий Павла по Македонии Тимофей был оставлен в Ефесе, чтобы противодействовать тамошним лжеучителям. Незадолго до своей смерти Павел зовет его прийти к нему по возможности скорее (2Тим 4:9, 2Тим 4:13). Из 1Тим 4:14, 2Тим 1:6, видно, что он был торжественно посвящен на служение через рукоположение Павла и пресвитеров (1Тим 1:18), вероятно, для предстоящей деятельности в Ефесе. Автор послания к евреям говорит о заключении некоего Тимофея, неизвестно когда (Евр 13:23).
Тимофей, судя по всему, был бескорыстным, самоотверженным и скромным человеком. Он охотно допустил обрезать себя (Деян 16:1 и дал.), нуждался в увещании «не пить одну воду» (1Тим 5:23); и был побуждаем к безбоязненному серьезному отношению к лжеучителям (1Тим 4:12, 1Тим 5:20, 2Тим 1:5, 2Тим 3:10). Коринфянам предлагалось оказать ему должную честь (1Кор 16:10).